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1、外源DNA片段成功插到載體里面（PCR鑒定），但無(wú)法表達(dá)蛋白
一般判斷目的基因是否表達(dá)，首先要進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。跑膠的時(shí)候一定要設(shè)對(duì)照：Marker，標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照，以及空白載體(誘導(dǎo))和重組載體(不誘導(dǎo))2個(gè)陰性對(duì)照，再加上誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)結(jié)果。跑SDS-PAGE的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在100ng左右；但是不能跟著做westernblot了。銀染的靈敏度在0.1～1ng；或是SyproRed，靈敏度高還可以繼續(xù)做Westernblot。
在做過(guò)WesternBlot仍沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)帶，那么就要先判斷載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，是否有因?yàn)槊盖羞B接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。其次要對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行確定，確定插入的每個(gè)堿基都是正確的，沒(méi)有意外終止的情況。zui后，也需要注意基因中是否有稀有密碼子，可更換表達(dá)菌株。
每種菌株都有自己*的設(shè)計(jì)，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采用不同調(diào)控機(jī)制會(huì)使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過(guò)載體的調(diào)控方式再換。例如，使用BL21(DE3)菌株表達(dá)不成功可以嘗試用Rosetta系列菌株表達(dá)，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這類(lèi)菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時(shí)不明原因的表達(dá)蛋白截短(比預(yù)期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密碼子造成的。
沒(méi)有發(fā)現(xiàn)原則性錯(cuò)誤之后，可以從表達(dá)條件入手，梯度條件改變表達(dá)溫度、IPTG濃度，低溫、較長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)有利于蛋白穩(wěn)定、融合表達(dá)；低濃度的IPTG可以減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷。而且培養(yǎng)基中的葡萄糖可能會(huì)抑制表達(dá)。導(dǎo)致表達(dá)的蛋白與預(yù)期的不同。如果嘗試改變條件后依然沒(méi)有表達(dá)，可以試試換不同的培養(yǎng)基（如LB、TB、M9等）。
如果以上方法均無(wú)法表達(dá)出目的蛋白，可更換載體-表達(dá)系統(tǒng)。在換過(guò)不同載體，不同菌株之后仍是表達(dá)不出來(lái)的話，可以嘗試其它的表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)橛行┑鞍资窃诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中無(wú)法表達(dá)。
蛋白表達(dá)出來(lái)了，但是跑SDS-PAGE時(shí)大小不符?
SDS-PAGE時(shí)蛋白的凈電荷會(huì)影響遷移率。帶電量高的蛋白會(huì)結(jié)合較少的SDS，阻礙蛋白的泳動(dòng)。富含脯氨酸的蛋白會(huì)在SDS-PAGE膠中移動(dòng)得特別慢。如果蛋白的等電點(diǎn)在5~9之間，并且組成的氨基酸組分沒(méi)有明顯的偏好，那么目的蛋白遷移率與預(yù)期相差較遠(yuǎn)就很有可能不是由于凝膠電泳造成的，可能是稀有密碼子造成表達(dá)產(chǎn)物的截短。利用C端或者N端的標(biāo)簽進(jìn)行WesternBlot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導(dǎo)致多條目的條帶或者比預(yù)期小很多的條帶出現(xiàn)。
重組表達(dá)的蛋白為不可溶包涵體
大多數(shù)在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白都是以包涵體形式存在。一般情況下，形成包涵體表達(dá)產(chǎn)率都很高，并且容易分離，得到比較純的包含體。包涵體致密的結(jié)構(gòu)有助于防止蛋白酶對(duì)它的降解作用，如果毒性較強(qiáng)的蛋白形成包涵體也就不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生太大的損傷。如果表達(dá)蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么可以用PBS將包涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫。包含體的形成據(jù)分析原因之一在于表達(dá)量過(guò)高，表達(dá)產(chǎn)物來(lái)不及折疊為活性形式——多數(shù)以高表達(dá)見(jiàn)長(zhǎng)的表達(dá)系統(tǒng)都會(huì)得到包含體產(chǎn)物。如果融合表達(dá)含有標(biāo)簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進(jìn)行純化，然后復(fù)性。
如何獲取可溶性蛋白
如果需要獲得具有一定活性的表達(dá)蛋白，那么讓蛋白可溶形式表達(dá)，避免包涵體形成。避免包涵體的方法很多，比如：選用表達(dá)量不高的表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的融合表達(dá)系統(tǒng)比如pThio，pMal等等，對(duì)于T7系統(tǒng)來(lái)說(shuō)降低或者減少誘導(dǎo)條件(例如降低ITPG濃度減少T7聚合酶)從而降低表達(dá)速度，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達(dá)。另外一個(gè)容易忽視的問(wèn)題是大腸桿菌內(nèi)還原性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不溶，更換菌株例如Novagen的Origami系列也有助于解決這個(gè)問(wèn)題。還有一種方法是當(dāng)?shù)鞍讙煸谥由系臅r(shí)候，在還原和氧化的谷胱甘肽存在的情況下用濃度從6M到0M的鹽酸胍過(guò)柱，促使蛋白的折疊。在蛋白重新折疊后用咪唑洗脫。德泰的上清蛋白表達(dá)服務(wù)通過(guò)條件矩陣正交優(yōu)化的方法，使重組蛋白表達(dá)在上清液中，即獲得具有相當(dāng)活性的表達(dá)蛋白
切除標(biāo)簽時(shí)引入的蛋白酶是否一定要切除?
很多時(shí)候我們要用蛋白酶除去加入的標(biāo)簽，在蛋白酶切除標(biāo)簽后是否一定要去除呢?有人認(rèn)為蛋白酶與目的蛋白加入的比例是1:500甚至更低，蛋白酶是不會(huì)影響到下一步操作的，在一些粗放的生化實(shí)驗(yàn)不用去處蛋白酶。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮罄^實(shí)驗(yàn)需要將蛋白酶除去。很多公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出帶有標(biāo)簽的蛋白酶，使得僅通過(guò)過(guò)親和柱就可以方便的去除蛋白酶和融合標(biāo)簽。Tag-Free技術(shù)與傳統(tǒng)的標(biāo)簽切除技術(shù)不同，不存在蛋白酶引入導(dǎo)致雜蛋白影響的情況，具體對(duì)比如下：
| 標(biāo)簽蛋白 | 無(wú)標(biāo)簽蛋白 | |
| 對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)功能影響 | 較長(zhǎng)的標(biāo)簽有可能限制重組蛋白折疊，影響蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能 | 無(wú)標(biāo)簽蛋白氨基酸序列與天然蛋白氨基酸序列基本相同，更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)免疫原性較易產(chǎn)生非特異性抗體，影響抗體制備保持蛋白抗原的天然結(jié)構(gòu)。 |
| 免疫原性 | 較易產(chǎn)生非特異性抗體，影響抗體制備 | 保持蛋白抗原的天然結(jié)構(gòu)。 |
| 蛋白結(jié)晶與X射線結(jié) 構(gòu)解析 | 額外的標(biāo)簽氨基酸可能造成晶體結(jié)構(gòu)改變，影響功能結(jié)構(gòu)分析 | 無(wú)額外的標(biāo)簽氨基酸更接近天然蛋白的構(gòu)象，更易結(jié)晶 |
| FDA藥檢審批 | 通常因含有額外引入的氨基酸，與天然蛋白序列存在差異，所以不易通過(guò)審核 | 與天然蛋白序列一致，易通過(guò)審核 |
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