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一．蛋白純化親和層析技術(shù)的原理
蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)適應(yīng)于理化性質(zhì)差異性較小而難分離的蛋白質(zhì)，親和層析利用固相介質(zhì)中的配基與混合生物分子之間親和能力不同而進(jìn)行分離，當(dāng)?shù)鞍状謽颖荆ɑ旌掀渌s蛋白、糖類、核酸及小分子）通過(guò)層析柱時(shí)，與配基能夠特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附固定在層析柱中，其他的蛋白質(zhì)、核酸等對(duì)配體不具有特異性的結(jié)合能力，將通過(guò)柱子洗脫下來(lái)，這種結(jié)合在一定條件下是可逆的，選用適當(dāng)?shù)南疵撘海淖兙彌_液的離子強(qiáng)度和pH值或者選擇更強(qiáng)的配體結(jié)合溶液將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，而無(wú)親和力的蛋白質(zhì)zui先流出層析住。
蛋白純化親和層析的固相載體具有穩(wěn)定的理化學(xué)性質(zhì)，是一種含有較多化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的羥基多糖類介質(zhì)，具有機(jī)械強(qiáng)度高，透性好，不溶于水，非特異性吸附少，多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。常用的載體有瓊脂糖凝膠（如GE公司），其他的載體如葡聚糖凝膠，多孔硅膠，樹脂，纖維素等，固相載體首先與特定的配體共價(jià)偶聯(lián)形成具有化學(xué)活性的基團(tuán)，即載體的活化，常見(jiàn)的對(duì)瓊脂糖凝膠的活化有這么幾種：溴化氰活化載體，即將含有氨基偶聯(lián)到載體的多糖基上（但溴化氰活化需謹(jǐn)慎，有ju毒氰化物放出），以及環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下活化載體，其他的載體的活化劑還有戊二醛等。配體指被特異性蛋白質(zhì)大分子所識(shí)別，并與蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用的基團(tuán)，如酶的作用底物，輔酶，激素受體，抗原與抗體的結(jié)合等。
蛋白質(zhì)與層析載體上的配體通過(guò)配位鍵（如His-tag與Ni2+）、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學(xué)專一性結(jié)合形成復(fù)合物。蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)通過(guò)目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體間通過(guò)特異性親和力吸附而達(dá)到分離純化的目的，具有生物專一性的特點(diǎn)，純化效率高。
二．蛋白純化親和層析的應(yīng)用分類
2.1抗原抗體的免疫親和層析
利用抗原與抗體之間的特異性親和力而進(jìn)行分離的方法。所需的蛋白質(zhì)作為抗原，經(jīng)過(guò)動(dòng)物免疫后形成抗體，抗體與活化的載體上的配基結(jié)合形成具有親和力的吸附系統(tǒng)，利用目標(biāo)蛋白與載體上的抗體特異性結(jié)合而達(dá)到分離純化蛋白的目的。
2.2金屬螯合配位層析
常用于分離對(duì)重金屬有較強(qiáng)親和力的蛋白。金屬螯合通常使用亞胺二乙酸（IDA）螯合劑，它與Ni2+、Co2+、Cu2+、Fe2+作用，形成帶有多個(gè)配位基的螯合物，固定在載體上，作為配體吸附對(duì)重金屬有特異結(jié)合能力的蛋白。例如利用基因工程構(gòu)建帶標(biāo)簽的蛋白His（組氨酸）標(biāo)簽融合蛋白，該蛋白對(duì)Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，因此，Ni2+等金屬離子能夠螯合His標(biāo)簽蛋白并吸附在固相載體上，而其他的蛋白質(zhì)不能結(jié)合或者僅能微弱的結(jié)合，從而能夠分離純化目標(biāo)蛋白。
2.3酶與底物特異性層析
GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽融合蛋白純化中，將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與重組蛋白或者多肽鏈融合，GST標(biāo)簽融合蛋白通過(guò)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與固相載體上的還原型谷胱甘肽之間通過(guò)酶與底物之間的特異性結(jié)合，從而達(dá)到和其他蛋白分離的目的。
2.4生物素和親和素
生物素和親和素之間具有很強(qiáng)的特異性的親和力。親和素作為配體固定在載體上，將生物大分子用生物素標(biāo)記，通過(guò)親和素特異性吸附標(biāo)記的生物大分子而純化分離目標(biāo)物質(zhì)。例如，生物素酰化的胰島素與以親和素為配體的瓊脂糖結(jié)合，胰島素被固定在瓊脂糖柱子上而得到分離。Enrichingbeads
2.5激素與受體蛋白
激素與受體蛋白具有高的親和力，因此親和層析是分離受體蛋白的重要方法。受體蛋白如乙酰膽堿、腎上腺素、生長(zhǎng)激素等，都可以利用激素與受體蛋白的特異性結(jié)合而分離。
2.6凝集素與糖蛋白
帶有糖基化的蛋白可用于含有外源凝集素的親和柱進(jìn)行分離，用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。
2.7輔酶
利用輔酶對(duì)多種酶的親和力可以對(duì)多種酶進(jìn)行分離純化。常用的輔酶有核苷酸及其衍生物，比如腺嘌呤核苷酸輔酶，AMP、ADP、ATP等，以及各種維生素，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。
2.8氨基酸表面疏水性 固定化氨基酸作為配體，利用氨基酸間的疏水性質(zhì)或者互補(bǔ)蛋白間的親和力，可以分離純化多種蛋白。
2.9多核苷酸和核酸配體
Poly-A配體能夠結(jié)合各種RNA、RNA聚合酶以及其他的poly-A結(jié)合蛋白。poly-U作為配體用于分離mRNA、以及各種poly-U結(jié)合蛋白。DNA作為配體，能夠特異性結(jié)合各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶等多種酶類。
Enriching Beads®中瓊脂糖磁珠專為蛋白親和純化而設(shè)計(jì)，相比傳統(tǒng)層析親和柱具有磁性分離快，操作簡(jiǎn)單且可以輕松實(shí)現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理的優(yōu)勢(shì)，磁性親和技術(shù)有望是新一代的親和工具。
Enriching Beads®對(duì)瓊脂糖磁珠進(jìn)行交聯(lián)并活化，如已活化好的NHS配基（加入配體在1個(gè)小時(shí)即可完成偶聯(lián)反應(yīng)），然后完成對(duì)特異性蛋白的親和吸附作用；還有環(huán)氧基、長(zhǎng)臂環(huán)氧基、氨基、醛基、羧基；有接入IDA并螯合Ni2+或者其他金屬離子可完成His-tag蛋白的純化；有偶聯(lián)谷胱甘肽并可純化GST融合蛋白；有共價(jià)偶聯(lián)Protein A、Protein G可完成免疫共沉淀或者抗體純化等等。
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